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小鼠瘦素检测试剂盒的操作流程是什么

发布时间: 2022-07-07  点击次数: 136次
 
  小鼠瘦素检测试剂盒是用纯化的抗体包被微孔板,制成固相载体,往包被抗该指标抗体的微孔中依次加入标本或标准品、生物素化的抗该指标抗体、HRP标记的亲和素,经过*洗涤后用底物TMB显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色,并在酸的作用下转化成Z终的黄色。颜色的深浅和样品中的该指标呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(OD值),计算样品浓度。
 
  小鼠瘦素检测试剂盒的操作流程:
 
  (1)待测样品孔中每孔加入待测样品100μl,每种样品设3个平行孔;设两个阴性对照孔,每孔加未处理组的细胞裂解液100μl;另设一个空白对照孔,加入纯细胞裂解液100μl。
 
  (2)酶标板置4℃,包被过夜。
 
  (3)洗板:吸干孔内反应液,用洗涤液过洗一遍(将洗涤液注满板孔后,即甩去),之后将洗涤液注满板孔,浸泡1-2分钟,间歇摇动。甩去孔内液体后在吸水纸上拍干。重复洗涤3-4次。
 
  (4)阴性对照孔每孔加入PBS50μl,样品孔及空白孔每孔加入1:500稀释的兔抗人AIF抗体工作液50μl。
 
  (5)酶标板置37℃培养箱的湿盒内,孵育60min。
 
  (6)洗板,同(4)。
 
  (7)每孔加1:5000稀释的HRP-标记的山羊抗兔抗体工作液100μl。
 
  (8)酶标板置37℃培养箱的湿盒内,孵育60min。
 
  (9)洗板,同(4)。
 
  (10)每孔加TMB显色液100μl,轻轻混匀10s,置37℃暗处反应15-20min。
 
  (11)每孔加100μl2mol/LH2SO4终止反应。
 
  (12)分别测450nm吸光值W1和630nm吸光值W2,最终测得的OD值为两者之差(W1-W2),以减少由容器上的划痕或指印等造成的光干扰。
 
  (13)数据处理:在得出标本(S)和阴性对照(N)的OD值后,计算S/N值。S/N≥2.1为阳性判定标准。
 
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